抗原多肽選擇的基本原則
發(fā)布時間：2020-09-15 06:25:23瀏覽次數(shù)：
1. 盡可能是在蛋白表面
2、保證該段序列不形成α-helix
3、N,C端的肽段比中間的肽段更好
4、避免蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)段的序列
5、避免同源性太強(qiáng)的肽段
6、交聯(lián)可以交聯(lián)在N、C兩端，選擇依據(jù)就是交聯(lián)在對產(chǎn)生抗體不太重要的一端
7、序列中不能有太多的Pro,但有一兩個Pro有好處，可以使肽鏈結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定一些，對產(chǎn)生特異性抗體有益。
為了使生產(chǎn)抗體獲得最佳效果，仔細(xì)地設(shè)計抗原多肽是很有必要的，設(shè)計應(yīng)滿足一個基本條件：在免疫過程中，該抗原既不會產(chǎn)生過強(qiáng)的免疫反應(yīng)，同時又能產(chǎn)生出對感興趣的蛋白有結(jié)合能力的抗體。盡管抗原設(shè)計是一個很復(fù)雜的課題，有諸多需要注意的細(xì)節(jié)，根據(jù)我們所積累的經(jīng)驗，有幾點關(guān)鍵的基本設(shè)計原則可以提供給大家參考：
1、確定抗體的用途
新開展一個研究項目，弄清楚所感興趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特別是如果知道蛋白的結(jié)構(gòu)會對選擇抗體易于接觸和識別的識別區(qū)域有很大的幫助。然而，在沒有這樣精確的結(jié)構(gòu)信息（多數(shù)是這種情況）的情況下，了解研究的用途會影響多肽設(shè)計的策略。例如：如果研究重點是集中在蛋白的不同區(qū)域，如C端或N端，或在一種特定狀態(tài)下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列設(shè)計的多肽和產(chǎn)生的相應(yīng)的抗體在應(yīng)用上應(yīng)該沒有太大的困難，然而，蛋白的構(gòu)象將影響抗體與其識別區(qū)域之間的相互作用。這種情況下可能存在的問題是如果在折疊的蛋白中，該識別區(qū)域被藏在蛋白的內(nèi)部，抗體將無法接觸到該區(qū)域。（無法產(chǎn)生相互作用）。
2、識別區(qū)域的選擇原則
一般說來最理想的抗原性識別區(qū)域應(yīng)具備親水、位于蛋白表面和結(jié)構(gòu)上易變形性等特點。因為在大多數(shù)的天然環(huán)境中，親水區(qū)域傾向于集中在蛋白表面，而疏水區(qū)域常常被包裹在蛋白內(nèi)部，同樣道理，抗體只能與在蛋白表面發(fā)現(xiàn)的識別區(qū)域相互作用，而當(dāng)這些識別區(qū)域有足夠的結(jié)構(gòu)易變形性而轉(zhuǎn)移到抗體可接觸的位置時，將會與抗體間有很高的親和性。
3、連續(xù)的與不連續(xù)的識別區(qū)域
連續(xù)的區(qū)域是指由連續(xù)的氨基酸序列構(gòu)成的識別區(qū)域。大多數(shù)抗體是針對連續(xù)識別區(qū)域的，抗體能與這類區(qū)域以很高的親和力相結(jié)合表明這段序列不在蛋白內(nèi)部。不連續(xù)的識別區(qū)域是代表有一定折疊的一段多肽序列，或是將兩段分離開的多肽連在一起的抗體的識別區(qū)域。在某些情況下，針對這樣不連續(xù)識別區(qū)域的抗體也能產(chǎn)生，只是用來免疫的抗原多肽必須具備與該不連續(xù)識別區(qū)域相似的二級結(jié)構(gòu)，而序列的長度需要符合相關(guān)的要求。
4、基本建議
為了避免識別區(qū)域隱藏在蛋白內(nèi)部的風(fēng)險，我們通常建議選擇蛋白的N，C兩端來產(chǎn)生的相應(yīng)的抗體。因為在完整的蛋白中，N，C兩端通常是暴露在蛋白表面的。然而，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太強(qiáng)，不適合作為抗原。
5、序列的長度
通常我們建議抗原多肽的序列長度在8-20個氨基酸殘基之間，如果太短，就有多肽太特殊、所產(chǎn)生的抗體與天然蛋白之間的親和力（結(jié)合能力）不夠強(qiáng)的風(fēng)險，同樣，如果序列長度超過20，將有可能引入二級結(jié)構(gòu)，所產(chǎn)生的抗體失去特異性的可能，而且肽鏈越長，通常合成難度增大，不易獲得高純度的產(chǎn)品。
6、載體蛋白交聯(lián)的選擇
基本原則：將載體蛋白加在遠(yuǎn)離抗體識別區(qū)域的一端，在序列中沒有Cys的情況下在N或C端加上Cys為交聯(lián)的首選方法。
7、常用分析軟件
MacVecfor TM ;DAN star TM;PC-Gene TM
多肽不穩(wěn)定的原因：
脫酰胺反應(yīng)：在脫酰反應(yīng)中，Asn/Gln 殘基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脫酰胺反應(yīng)的進(jìn)行。 在Asn-Gly-結(jié)構(gòu)中的酰胺基團(tuán)更易水解，位于分子表面的酰胺基團(tuán)也比分子內(nèi)部的酰胺基團(tuán) 易水解。
氧化多肽溶液易氧化的主要原因有兩種，一是溶液中有過氧化物的污染，二是多肽的自發(fā)氧 化。在所有的氨基酸殘基中，Met、Cys和His、Trp、Tyr等最易氧化。氧分壓、溫度和緩沖 溶液對氧化也都有影響。
水解：多肽中的肽鍵易水解斷裂。由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷裂，尤其是 Asp-Pro和Asp-Gly 肽鍵。
形成錯誤的二硫鍵：二硫鍵之間或二硫鍵與巰基之間發(fā)生交換可形成錯誤的二硫鍵，導(dǎo)致三 級結(jié)構(gòu)改變和活性喪失。
消旋：除Gly外，所有氨基酸殘基的α碳原子都是手性的，易在堿催化下發(fā)生消旋反應(yīng)。其 中Asp殘基最易發(fā)生消旋反應(yīng)。
β-消除：β-消除是指氨基酸殘基中β碳原子上基團(tuán)的消除。Cys、Ser、Thr、Phe、Tyr 等 殘基都可通過β-消除降解。在堿性PH下易發(fā)生β-消 除，溫度和金屬離子對其也有影響。
變性、吸附、聚集或沉淀變性一般都與三級結(jié)構(gòu)以及二級結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)。在變性狀態(tài)，多 肽往往更易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，活性難以恢復(fù)。在多肽變性過程中，首先形成中間體。通常中間 體的溶解度低，易于聚集，形成聚集體，進(jìn)而形成肉眼可見的沉淀。
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